醫(yī)療器械的常用滅菌方法及驗證
發(fā)布：合翔包裝 時間：2022-10-09醫(yī)療器械產品滅菌的目的，是使產品無任何類型的存活微生物，在滅菌過程中，微生物的死亡規(guī)律是用指數函數表示的。因此任何單位產品上微生物的存在可用概率表示，概率可以減少到很低，但不可能為零。該概率可用無菌保障水平 (SAL) 表示，通常無菌概念是指無保障水平 (SAL) 達到 10-6。
醫(yī)療器械滅菌驗證一般分為安裝確認 (IQ)、操作確認 (OQ) 和性能確認 (PQ)。
安裝確認是指：獲得證據并用文件證明滅菌設備及其附屬設施，已按照規(guī)定的要求被提供和安裝。
操作確認是指：當設備按程序運行時，獲得證據并用文件來證明已安裝的設備，有能力在指定的允差范圍內提供特定的過程。
性能確認是指：獲得證據并用文件證明設備能夠在預先設定的參數下持續(xù)運行，且這個過程加工后的產品是無菌的。性能確認一般包括物理性能確認和微生物性能確認，器械所使用的材料對滅菌方法的適用性，也是 能驗證中的重點。
本文結合國際上最新的滅菌相關標準，介紹了無菌醫(yī)療器械生產的幾種常用的滅菌方法及其驗證要點，如環(huán)氧乙烷滅菌 (EO 滅菌 )、輻照滅菌、高壓蒸汽滅菌和甲醛蒸汽滅菌等，以供醫(yī)療器械研究和生產單位參考。
一、環(huán)氧乙烷滅菌
20 世紀 50 年代起環(huán)氧乙烷(ethylene oxide, EO)開始用于醫(yī)院滅菌。經過眾多科學家的研究證明，環(huán)氧乙烷被認為是一種滅菌效果較好的低溫化學滅菌劑，在常溫下即有良好的穿透作用，對物品無損害，而被廣泛用于畏熱、畏濕的醫(yī)療器械產品滅菌中。
1.1 滅菌原理
EO 是一種簡單的環(huán)氧化合物，遇水可形成乙二醇，具有較大的蒸汽壓，對物品的穿透性較強。據報道，EO5min 能穿透 0.1mm 厚的尼龍薄膜，26min 能穿透 0.3mm 的氯丁膠布，41min 能穿透 0.39mm 厚的丁基橡膠布。
如果要達到一定的滅菌效果，滅菌劑必須充分接觸物品的各個表面，EO 的這種高穿透性大大提高了其滅菌效果。EO 對細菌、芽孢、真菌、立克次體和病毒等各種微生物具有殺滅作用，屬于光譜殺菌劑，其滅菌機理是與細菌蛋白質分子、酶、核酸中的氨基、羥基、羧基相結合，產生烷基化作用，對菌體細胞的代謝產生不可逆的破壞，從而達到滅菌作用。
1.2 滅菌驗證
環(huán)氧乙烷滅菌的驗證包括以下 3 個步驟：
安裝確認：一要確認滅菌器隨機文件和附件的完整性，如安裝記錄、圖紙、計算機軟件、計量裝置的校準等，二要對滅菌器工作環(huán)境的符合性進行驗證，如水質檢測、安全要求等，三是要驗證滅菌器安裝是否符合設備安裝要求，要確認滅菌劑的濃度及質量狀況。
操作確認：驗證滅菌設備有能力在指定的允差范圍內提供特定的過程，如溫度分布試驗、濕度分布試驗、泄漏試驗、真空速率試驗、空氣循環(huán)試驗 ( 如果使用 ) 等。
性能確認：包括物理性能確認和微生物性能確認。
物理性能確認，應書面證明過程的重現性，并且符合所有指定的可接受參數。這些過程包括預處理、處理、滅菌和通風階段等，操作重現性確認一般至少需要3 次連續(xù)運行，適當時進行微生物挑戰(zhàn)試驗。環(huán)氧乙烷是致癌物，通風次數和解析放置的溫度與時長對環(huán)氧乙烷的殘留的影響，也需要作出相應的評價。
微生物學性能驗證，目的是應書面證明在滅菌過程后，產品的無菌性能已經達到特定的要求 (SAL=10-6)。
微生物性能驗證的方法有：生物負載法和過度滅菌法。
一般情況下，EO 滅菌微生物性能確認均采用生物指示劑 (BI，枯草桿菌芽孢 )。進行微生物學性能驗證的產品，應采用與其常規(guī)滅菌相同的包裝，生物指示物應放置在被滅菌物品中最難滅菌的部位，并在預處理前就放入選定部位，且在整個滅菌周期保持該位置。
生物指示物監(jiān)測點的數量應能驗證滅菌器內全部被滅菌物品的微生物滅活，通常滅菌室體積≤10m3時，驗證時至少設置體積 V×3 個檢測點，但不少于 5 個，日常監(jiān)測至少設置 V×1.5 個檢測點，但不少于 5 個。
滅菌室體積在>10m3時，驗證時至少設置體積 30＋(V-10)×3 個檢測點，日常監(jiān)測至少設置 15+(V-10)×1.5 個檢測點。這里還涉及到溫濕度探頭的數量等要求，不同體積的滅菌器有不同的要求，可查閱 ISO 11135-1:2007 附錄 C。
由于環(huán)氧乙烷滅菌不存在通用的經典滅菌參數，影響滅菌效果的因素多且相互關聯(lián)，滅菌過程控制復雜，所以為了保證滅菌效果，對其滅菌過程進行嚴格的驗證是必要的。此外，若滅菌設備、被滅菌物品和裝載方式任何一個因素改變時，都需要重新進行驗證。
1.3 產品放行
日常監(jiān)測中，需要監(jiān)測預處理時的溫度和濕度、處理過程中滅菌柜內的濕度和時間、整個滅菌過程的溫度和壓力、環(huán)氧乙烷已注入的證據、滅菌時間、解析時的溫度和壓力變化。最終只有生物指示物 (BI) 培養(yǎng)全部顯陰性且滅菌過程參數在性能驗證的參數范圍內，產品才可以放行。
1.4 應用
EO 可用于不耐高溫、不耐濕物品的滅絕，被認為是一種滅菌效果最好的化學滅菌劑，可殺死所有微生物包括細菌以及芽孢。EO 具有極強的穿透性，可用以各種難通透部位的滅菌，如有些較細、較長的導管用其他低溫滅菌方法很難達到滅菌效果，而只能選擇 EO或者輻照。
EO 滅菌對物品的損害也較小，滅菌是利用烷基化原理而非氧化過程，對不耐熱的材料及設備有著非常廣泛的應用前景。采用 EO 滅菌時，可以用各種包裹材料包裹，便于儲存、運輸，打開包裝即可使用避免了交叉污染的危險，并且在滅菌過程中，有標準的化學、生物監(jiān)測手段，從而可以有效的控制滅菌質量。
EO 在臨床上有著廣泛的用途，采用 EO 滅菌的設備及產品包括：
硬式和軟式內鏡，如：關節(jié)鏡、氣管鏡、膀胱鏡、胃鏡、腸鏡、眼底鏡、耳鏡、尿道鏡、胸腔鏡等等；
醫(yī)療設備，如：麻醉設備、人工腎、透熱設備、電線、表頭、心肺機、血透等；
儀器：電鉆、電燒器、牙鉆、顯微手術器、神經刺激器、壓力計、外殼手術起、骨鉆、針頭、人工關節(jié)等；
橡膠制品：導管、擴張器、引流管、氣管內插管、手套、起搏器、心瓣膜、噴霧器等等。
2、60Co-γ輻照滅菌法
上世紀 50 年代末，各國紛紛建造大型的 60Co-γ射線輻照源，用于商業(yè)化的輻照加工。從此 60Co-γ射線滅菌技術的應用領域迅速擴展，從最初對一次性使用的醫(yī)療用品滅菌拓展到醫(yī)療器械材料滅菌、醫(yī)療藥品滅菌、食品滅菌保鮮、一次性生活用品滅菌、環(huán)境微生物污染治理等多個方面。
60Co-γ射線滅菌有很多的優(yōu)點，如不用做生物指示物(BI) 或產品的無菌實驗、在滅菌過程中溫度變化很小、射線可以到達器械管腔內部、滅菌后的產品不需要再處理，可以直接使用。但 60Co-γ射線對高分子材料和包裝材料破壞性有一定的破壞作用，滅菌站對人和環(huán)境也存在污染的風險，因此60Co-γ射線的應用也受到了很大的限制。
2.1 滅菌原理
輻照技術是 20 世紀發(fā)展起來的一種滅菌保鮮技術，是以輻射加工技術為基礎，運用 X 射線、γ射線或高速電子束等電力輻射產生的高能射線，在能量的傳遞和轉移過程中，產生強大的物理效應和生物效應，達到殺蟲、殺菌、一直生理過程的目的。
其原理主要是破壞細菌細胞中的 DNA 和 RNA，受損的 DNA 和 RNA 分子發(fā)生降解，失去合成蛋白質和遺傳功能，使細胞死亡。 60Co-γ頻率高到 3×1018~3×1021Hz，其能量大于分子鍵能，故可使分子電離和斷鍵而殺菌。
其殺菌機理為 60Co-γ射線直接破壞微生物的 DNA、蛋白質和酶而致死，或者被微生物中的水吸收而激發(fā)或電力，產生激發(fā)的水分子、電子、水離子，或裂解為氫自由基、羥自由基，由此產生一系列的與 DNA、蛋白質、酶的氧化還原反應，致微生物死亡。
2.2 滅菌驗證
輻照滅菌的驗證包括以下主要內容：
安裝確認：確認輻射源 ( 源的活性或加速器的參數 )、傳送系統(tǒng)、附屬設施 ( 包括相關的軟件 )、計量裝置的計量狀態(tài)、工作環(huán)境的符合性進行驗證，如安全要求等。
操作確認：針對每個傳送系統(tǒng)，通過測量不同位置的吸收劑量驗證不同的輻照容器的計量分布，不同輻照容器以及容器內的不同位置的吸收劑量都在規(guī)定的范圍內。一般在加源后、源的位置及形態(tài)改變、傳送系統(tǒng)變化、輻照容器改變時都需要進行操作確認。
性能確認：包括物理性能確認和微生物性能確認。
物理性能確認包括確認產品放裝載模式、包括日常產品的包裝方式 ( 尺寸，密度等 )，劑量分布、包括最大和最小吸收劑量及位置，產品的最大可吸收劑量 ( 評價滅菌劑量對產品的影響 )。
微生物學性能驗證，目的是應書面證明在滅菌過程后，產品的無菌性能已經達到特定的要求 (SAL=10-6)。
2.3 產品放行
輻照滅菌的產品批次放行采用參數放行，不需要進行無菌實驗。通過放置在最大可吸收劑量點和最小可吸收劑量點的劑量計，檢測每批次滅菌的最大和最小劑量，最大和最小滅菌劑量在驗證劑量的范圍內，產品即可放行。
這一放行準則是基于定期的輻照滅菌劑量審核，審核內容一般涉及到生物負載限度、微生物特性分析、建立滅菌劑量的方法等。
2.4 應用
在使用 60Co-γ射線滅菌時，不同菌種，甚至同一菌株的不同發(fā)育階段的抗輻射性均不同。一般來講，細菌的營養(yǎng)細胞抗輻射性弱，芽孢的抗輻射性強。同一種菌株在不同介質中的抗輻射性也是不同的。在有抗菌劑存在的條件下，大多數菌的抗輻射性增強，在缺氧條件下，菌種的抗輻射性也有所增強。一般來說輻照劑量大，滅菌效果好。但是輻照劑量過大，對樣品中的某些成分可能會有一定得影響，因此在具體的輻照實踐中需要確定輻照劑量。
由于γ射線本身的能量大、輻射強，對物質損害大，對輻射滅菌產品的材質有一定的要求。有些產品在滅菌后出現了材質的強度、清晰度、顏色、生物相容性以及包裝的完整性等方面的問題，有的是在輻射滅菌完成后不久便顯現出來，這主要是因為部分企業(yè)的產品特別是所用的包裝材料不適合輻射滅菌方式。
對于適合輻射滅菌的產品和材質的選擇，在 GB18280-2000《醫(yī)療保健產品滅菌確認和常規(guī)控制要求輻射滅菌》的附錄 A 中給出了器材材料和包裝材料的確認方法；在GB16352《一次性醫(yī)療用品γ射線輻射滅菌標準》的附錄 C 中則較為詳細的列舉了適合輻射滅菌的醫(yī)療用品。
3、高壓蒸汽滅菌
高壓蒸汽滅菌是熱力消毒方法中最普遍、效果最可靠的一種滅菌方法，其優(yōu)點是蒸汽穿透力強，能殺滅所有微生物。
3.1 滅菌原理
高壓滅菌是濕熱消毒法的一種，其原理是：在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。
在 0.1MPa 的壓力即 103.4kPa(1.05kg/cm2) 蒸汽壓下，鍋內溫度達 121℃，維持15~30min。當溫度超過細胞最佳生理活動的溫度范圍時，細胞代謝減緩，細胞的蛋白質、酶及核酸會被永久性破壞，從而導致細胞發(fā)生不可逆轉的死亡。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢，是最可靠、應用最普遍的物理滅菌法。
3.2 滅菌驗證
滅菌驗證一般分為以下幾部分內容。
安裝確認：一要確認滅菌器隨機文件和附件的完整性，如安裝記錄、圖紙、計算機軟件、計量裝置的校準 ( 溫度表、壓力表、時間計量表 ) 等；二要對滅菌器工作環(huán)境的符合性進行驗證，如水質檢測、安全要求等；三是要驗證滅菌器安裝是否符合設備安裝要求，確認滅菌劑的濃度及質量狀況。
操作確認：驗證滅菌設備有能力在指定的允差范圍內提供特定的過程，如熱分布試驗、包括空載熱分布試驗等。
性能確認：物理性能確認和微生物性能確認，包括滿載熱分布試驗 ( 最高最低溫度點 )熱穿透試驗等，生物指示物的使用等。
3.3 產品放行
日常監(jiān)測中，需要監(jiān)測預處理時的溫度、整個滅菌過程的溫度和壓力等。最終只有生物指示物 (BI) 培養(yǎng)全部顯陰性且滅菌過程參數在性能驗證的參數范圍內，產品才可以放行。
3.4 應用
由于高壓蒸汽滅菌本身具備不破壞產品表面并藥品、藥品溶液、玻璃器械、培養(yǎng)基等在高溫高濕條件下不發(fā)生變化或損壞的物質，均可以采用高壓滅菌法。
高壓蒸汽滅菌已經被廣泛地應用到各種生化實驗室和醫(yī)院，用于一些培養(yǎng)基、玻璃制品、生理鹽水等的滅絕。
目前的高壓蒸汽滅菌器的類型和樣式較多，如：
①下排氣式壓力蒸汽滅菌器是普遍應用的滅菌設備，壓力升至 102.9kPa(1.05kg/cm2)，溫度達121~126℃，維持 20~30min，可達到滅菌目的。
②脈動真空壓力蒸汽滅菌器已成為目前最先進的滅菌設備。滅菌條件要求：蒸汽壓力205.8kPa(2.1kg/cm2)，溫度達132℃以上并維持 l0min，即可殺死包括具有頑強抵抗力的細菌芽胞在內的一切微生物。
高壓蒸汽滅菌的注意事項：
(1) 必須先用流通蒸汽或真空排除滅菌器腔內空氣。若滅菌器內有空氣存在，則壓力表上所指示的壓力是滅菌器內蒸汽和空氣二者的總壓，結果壓力雖達到要求，但滅菌溫度卻達不到，達不到滅菌效果。
(2) 滅菌時間必須是從全部裝載的滅菌物均已達到滅菌溫度時開始計算。
(3) 裝載方式的確定，不同的裝載類型須驗證確認，避免隨意性。
(4) 高壓蒸汽滅菌器必須進行周期性驗證。
4、甲醛蒸汽滅菌
現代的低溫蒸汽甲醛滅菌 (Sterilization by Low Temperature Steam Formaldehyde, LTSF) 方法，是上世紀 60 年代發(fā)明的一種低溫滅菌技術，使用負壓低溫蒸汽甲醛法對一些怕熱怕濕的醫(yī)療器械進行滅菌。
4.1 滅菌原理
甲醛殺菌作用是阻止細菌核蛋白的合成，影響生物細胞漿基本代謝。一些研究指出，甲醛為強烷化劑，其殺菌原理是一種非特殊性的烷基化作用，甲醛分子直接作用于細菌的菌體蛋白質、酶以及核酸的活性基團，使蛋白質鏈上的氨基、壓氨基、羥基、羧基等烷基化，從而破壞細菌的蛋白質，導致微生物的死亡。
其中烷基化效應包括兩種作用：一是可降低水對蛋白質的穿透、彭潤作用，使其硬化；二是對核酸的烷基化反應，可導致病毒的滅活。
甲醛對細菌繁殖、芽孢、分枝桿菌、真菌和病毒等各種微生物都有高效的殺滅作用。甲醛對細菌病毒素亦有破壞作用，對肉毒桿菌素和葡萄球菌腸毒素，用 50g/L 甲醛水溶液作用 30min 可將其完全破壞。
4.2 滅菌驗證
無菌生產環(huán)境甲醛蒸汽滅菌驗證，驗證的目的為甲醛滅菌的時間、排風時間及效果驗證。確保無菌環(huán)境中用甲醛滅菌提供的空氣環(huán)境始終復合國家《藥品生產質量管理規(guī)范》對潔凈室中空氣浮游菌及表面細菌的規(guī)定。
在準備甲醛蒸汽滅菌的房間取樣點位置放入驗證裝置，指示物采用枯草桿菌芽孢。取樣點數量根據滅菌區(qū)域面積確定。在≤ 9m3的空間放置 2 個取樣點，在小于 14m3大于 9m3的房間放置 3 個取樣點，大于 14m3的空間放置 4 個取樣點。
在無菌生產環(huán)境中取樣點設置在分裝機罩內、出瓶轉盤、分裝間回風口、分裝間回風管、分裝機底部。在滅菌后進行取樣點菌片培養(yǎng)，將菌片接種于培養(yǎng)液中 37℃培養(yǎng)至7d，若無菌生長則判斷滅菌合格。
目前國內對低溫甲醛蒸汽滅菌器功效檢驗尚沒有標準，對低溫甲醛蒸汽滅菌器的滅菌效果生物指示劑也沒有專門研究定標，因此這將影響低溫蒸汽甲醛滅菌技術的研究和推廣應用。
甲醛熏蒸法滅菌目前使用較少，驗證及產品放行準則可參照國際標準 ISO 25424:2009。
4.3 應用
常溫常壓下使用甲醛熏蒸消毒主要利用化學法和加熱法產生甲醛氣體。將福爾馬林或多聚甲醛與某些強氧化劑如高錳酸鉀、氯制劑等發(fā)生化學反應，通過化學產熱促使甲醛氣化。加熱法是將福爾馬林或多聚甲醛直接用電加熱，使甲醛氣化進行熏蒸消毒。
有研究用每立方米 120ml 福爾馬林與 60g 高錳酸鉀混合反應產生甲醛氣體熏蒸 1h，可使物體表面達到消毒，熏蒸 75min 可使尿管達到有效消毒。甲醛熏蒸消毒后會殘留濃烈的甲醛刺激性氣味，可以采用化學中和法進行消除。在熏蒸消毒結束后，在熏箱底層放入一定量的濃氨水繼續(xù)熏蒸 30min 可以降低刺激性氣味。
甲醛可用于對怕熱怕濕怕腐蝕的醫(yī)療用品的消毒與滅菌，可采用低溫蒸汽甲醛滅菌的器材主要有：
外科器械、包括導氣管、麻醉用具、關節(jié)鏡、心導管、腹腔鏡、膀胱鏡等；
診療器械有血氧合器、濕化器、注射器、呼吸機、乳膠導管、乳膠手套等；
電子器材有植入電極、變壓器、電位器、電容器、導線以及眼科手術使用的熱敏器材等。
